染色体G显带技术——万融实验

【实验目的】

掌握G显带染色体标本的制作历程；通过G显带核型分析，相识小鼠各条染色体G带的带型特征。

【实验原理】

染色体显带技术是在非显带技术的基础上生长起来的，它能显示染色体自己更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。

染色体显带技术是染色体标本经由一定处置惩罚，并用特定染料染色，使染色体显现明暗或深浅相间的横行带纹。通过显带技术，使各条染色体都显现出奇特的带纹，这就组成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基底细同而且稳定，差别对染色体的带型差别。

凭据显带方法差别可分为Q显带、G显带、C显带、T显带等，其中G显带技术最为常用。将染色体标本用碱、胰卵白酶或其他盐溶液处置惩罚，使染色体上的卵白质变性，再用Giemsa染液染色，普通显微镜下可视察到深浅相间的带纹，易着色的阳性带（Positive Band）为富含A-T的染色体节段，相反，G-C含量多的节段则不易着色，为阴性带（Negative Band）。G显带方法轻便，带纹清晰，染色体标本可以恒久生存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

本实验接纳小鼠骨髓细胞染色体标本，举行G显带及G显带核型分析。小鼠是遗传学研究常用的实验动物，其染色体数目是40条，正常小鼠的核型对肿瘤研究、杂交细胞染色体的分析，以及基因定位等事情都是须要的。

【实验工具】

昆明种小鼠。

【实验质料】

器材：光学显微镜，37℃水浴箱，普通冰箱，立式染缸，切片架，切片盒，烧杯，量筒，直头小吸管，pH试纸，吸水纸，香柏油，二甲苯，擦镜纸，镊子。

试剂：秋水仙素，生理盐水，Giemsa染液，0.25%胰卵白酶溶液。

【实验步骤】

（一）小鼠染色体标本制备

1. 注药 取18～22g小鼠，正法前2～3小时腹腔注射秋水仙素，每10g体重注射0.04%秋水仙素0.1mL，以积累破裂相细胞。

2. 正法 脱颈椎法正法小鼠，即用左手拇指、食指牢固小鼠头后部，右手捏住鼠尾，用力向后上方牵拉，使小鼠颈椎脱臼死亡。

3. 取骨髓 用铰剪剪开后肢的皮肤和肌肉，取出股骨，用一小块纱布往返搓洁净附在骨上的血渍和肌肉残渣。剪掉少许股骨两头膨大的枢纽头（注意：两头的骨髓中含有许多的破裂相细胞，不宜剪去太多），吸取3mL低渗液于小平皿中，用铰剪只管剪碎股骨，漂洗，然后将上清液吸入15mL离心管中。

4. 低渗 将装有低渗细胞悬液的离心管置37℃水浴20分钟。低渗处置惩罚可借渗透作用使细胞膨胀，染色体铺展，还可使黏附于染色体的核仁物质散开，使染色体疏散良好。

5. 预牢固 取出离心管，在细胞悬液中加入2～3滴新配制的牢固液（甲醇∶冰醋酸=3∶1），立刻用吸管吹打匀称，经1500r/min离心8分钟，吸去上清，留沉淀物。

6. 牢固 加入牢固液5mL于离心管，用吸管打散细胞团成匀称悬浮液，室温牢固15分钟，然后以1500r/min离心8分钟，吸去上清。重复牢固一次，步骤同上，离心后吸去上清，再加入1～2滴牢固液。

7. 滴片 将细胞团吹打匀称，取失事先在冰水中预冷的载玻片，立刻吸取细胞悬液，距载玻片约莫30cm的高度滴片，滴加的悬液不能重叠，立刻瞄准玻片吹气使细胞迅速疏散。每个样品制2～3张玻片，空气中自然干燥，待晾干后染色。

（二） G显带

1消化 将配制好的0.25%胰酶溶液装入立式染色缸中并调pH值至7.0，将其放入37℃恒温水浴箱中预温。取染色体制片置胰酶缸中处置惩罚5～30秒，期间要不停地轻轻摇动，使胰酶处置惩罚匀称。

2. 漂洗 立刻取出玻片放入生理盐水中冲洗两次，用滤纸吸去多余水分。

3. 染色 将标本浸入37℃预温的Giemsa染液〔1∶10的Giemsa原 液 和PBS（pH6.8）〕中染色15～20分钟。

4. 漂洗 将标本用自来水冲洗（冲洗要小 心）、晾干或用滤纸吸干。

5. 分析 显微镜下视察染色体显带效果。先在低倍镜下选择疏散良好的破裂相，然后转换油镜视察其显带的情况（若染色体未泛起带纹，则为显带不足，若染色体边缘发毛为显带过头，此时应凭据详细情况增减胰卵白酶处置惩罚时间重新处置惩罚一张标本）。依次找出各号染色体和性染色体，绘成草图。各染色体的位置、形状巨细只管真实（不必绘出带型），并在各染色体旁边标明染色体序号。

6. 照相 挑选出数目完全且带纹清晰的破裂相，举行显微照相、冲洗、放大，制成小鼠骨髓细胞染色体标本G显带中期破裂相照片。

【效果与分析】

1. 获得带纹清晰的小鼠骨髓细胞染色体G显带标本。

2. 在显微镜下视察染色体G显带核型，举行染色体分析。