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——Carl H. June

肿瘤免疫细胞治疗走过了几十年的生长历程，从最初的免疫细胞体外扩增回输，到2017年FDA批准的过继型自体免疫细胞疗法CAR-T，再到最近的通用性CAR-T技术。肿瘤细胞免疫治疗技术逐渐走向成熟。作为CAR-T技术的发现人，宾州大学的Carl June教授履历这个技术的兴起。2020年2月6日，Carl June团队在Science杂志上在线揭晓了一篇名为“CRISPR-engineeredT cells in patients with refractory cancer ”的文献，报道了一期临床实验的最新希望，重点分析经由基因魔剪CRISPR-CAS9技术革新后的免疫细胞NYCE细胞的体内宁静性。【1】

临床试验方案

▲引自 Science

▲引自 Science

一期临床试验(编号ClinicalTrials.gov NCT03399448)旨在证明自体泉源的新型CAR-T技术的宁静性和可行性。该新型CAR-T技术的创新点在于：1. 新型的NY-ESO-1 TCR基因修饰技术；2.CRISPR-CAS9同时敲除TRAC, TRBC 和PDCD1三个基因。敲除内源TRAC和TRBC基因能够提高外源TCR的表达稳定性，敲除PDCD1则能够提升免疫细胞的活力。因此，他们的基因工程革新后的T细胞被命名为：“NYCE” （NY-ESO-1transduced CRISPR 3X edited cells），其制备方案如上图所示。

满足临床入组尺度的病人一共有三位：一位罹磨难治-转移sarcoma肉瘤病患，和两位罹磨难治-希望的myeloma骨髓瘤病患。他们回输的T细胞剂量为1*10^8 细胞/公斤。

NYCE细胞的质检放行尺度如下图所示：

▲引自 Science

基因编辑T细胞的表征

▲引自 Science

NYCE细胞制备好后，虽然研究人员发现这些细胞中TRAC，TRBC和PDCD1的基因实际突变频率靠近30%。在体外肿瘤杀伤实验中，这些NYCE细胞能够体现出越发优异的杀伤能力，相比单TCR或者单CRISPR处置惩罚的细胞而言。

▲引自 Science

研究人员发现，经由基因编辑革新的NYCE细胞平均半衰期为83.9天，而且在NYCE细胞回输病人的九个月以后，这种NYCE细胞仍然能够被检测出。以其中一个病患的情况为例， NYCE细胞回输病人前的基因编辑频率为30%（三重编辑和二重编辑的基因型），四个月后的，病人体内的表达外源TCR转基因的T细胞亚群中，基因编辑频率（三重编辑和二重编辑的基因型）仍能够维持在20%.

在之前的研究中，无基因编辑处置惩罚的CAR-T细胞的半衰期仅有一周时间。说明基因编辑可以增强CAR-T细胞的耐久性。这一惊讶的效果令人兴奋，这种生存期的延伸很有可能与TRAC, TRBC 和PDCD1三个基因编辑，以及TCR载体设计相关。

基因编辑T细胞的宁静性评价

学界对基因编辑（Crispr-CAS9）的宁静性挂念主要有两个方面：第一，CAS9卵白引起的免疫原性；第二，CRISPR-CAS9基因编辑引起的脱靶效应。

▲引自 Science

为了研究解答这两方面的宁静性挂念，作者做了如下实验。首先，在NYCE细胞扩培-制备的历程中，CAS9卵白的含量是逐渐降低的；其次，NYCE细胞回输病人以后，病人体液免疫中的抗CAS9抗体并没有发生显着的变化。这说明该治疗方案中，CAS9免疫源性方面的宁静性是很是可靠的。

▲引自 Science

作者以TRAC位点为例，分析了NYCE细胞中的基因打靶和脱靶的序列情况。虽然一些的脱靶突变被发现，但并没有NYCE细胞发生转化，说明这些脱靶事件并没有造成危险的结果。虽然作者认为这些临床效果中宁静性的指标都切合期望，作者仍然审慎地认为更高剂量以及更长视察期的临床实验可能还是需要的。

结论

对于研究者而言，本次一期临床试验的目的已到达，即这种基因编辑的CAR-T临床治疗方案是宁静可行的。CAS9卵白的免疫源性并没有造成宁静性的影响。本次实验中的NYCE细胞PD1基因是被敲除的，在临床历程中，未发现过量T细胞毒性引起的自身免疫疾病。TRAC和TRBC基因的敲除降低了内源TCR亚基对外源基因的竞争。虽然一些染色体易位事件在NYCE细胞中被发现，可是在免疫细胞，尤其是T细胞中，染色体易位的本底突变频率比力高，携带易位的T细胞可存活数月至数年而无致病性。因此，总体上而言，这些基因编辑后的CAR-T细胞的宁静性是可以接受的。即便如此，作者仍然建议在未来，需要编辑效率更高的基因编辑技术和视察期更长的临床试验，来进一步证明该CAR-T方案的宁静性。相信在不远的未来，基因编辑技术武装的CAR-T细胞会变得更强大更持久，最终资助人类战胜实体瘤。

参考资料：

【1】Stadtmauer, E. A. et al.CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science (80-.). 7365, 1–20 (2020).

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