大熊猫源致病大肠杆菌CCHTP全基因组测序及耐药和毒力基因分析

大熊猫源致病大肠杆菌CCHTP全基因组测序及耐药和毒力基因分析

邓雯文1，李才武1，赵思越2，李仁贵1，何永果1，吴代福1，杨盛智2，黄炎1，张和民1，邹立扣2

1. 中国大熊猫掩护研究中心，大熊猫国家公园珍稀动物掩护生物学国家林业和草原局重点实验室，都江堰 611830

2. 四川农业大学资源学院，成都 611130

http://www.chinagene.cn/CN/10.16288/j.yczz.19-243

摘要:致病性大肠杆菌是引起动物泌尿系统熏染的重要病原菌，本研究对泌尿生殖道熏染泛起潜血的大熊猫尿液中分散的一株致病性大肠杆菌(Escherichia coliCCHTP)举行全基因组测序，检测其中耐药基因和毒力因子的情况，同时对基因岛上耐药和毒力基因及其基因情况举行研究。研究发现，大肠杆菌CCHTP中存在多种类型的耐药基因，其中外排泵系统基因数量最多，包罗mdfA、emrE和mdtN等介导多重耐药外排泵的基因。此外，该菌还携带166种毒力因子及563个相关毒力基因，其中属于黏附与侵袭类的毒力因子及相关基因数量最多。对19个基因岛分析发现，基因岛GIs011和GIs017中各有一段包罗耐药和毒力基因的序列，两侧与可移动遗传元件(转座酶和插入序列)相连，这些结构可能介导耐药及毒力基因水平转移。本研究通过全基因组测序分析了大熊猫源致病性大肠杆菌中存在的耐药及毒力基因情况，对大熊猫相关疾病的科学治疗、合理用药有重要意义。

关键词:大熊猫；大肠杆菌；全基因组测序；耐药基因；毒力因子

Whole genome sequencing reveals the distribution of resistance and virulence genes of pathogenicEscherichia coliCCHTP from giant panda

Wenwen Deng1, Caiwu Li1, Siyue Zhao2, Rengui Li1, Yongguo He1, Daifu Wu1,

Shengzhi Yang2, Yan Huang1, Hemin Zhang1, Likou Zou2

1. China Conservation and Research Centre of the Giant Panda,Key Laboratory of SFGA on Conservation Biology of Rare Animals inthe Giant Panda National Park,Dujiangyan 611830, China

2.Faculty of Applied Microbiology, College of Resources, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

Abstract:PathogenicEscherichia coli (E. coli)is the most common pathogen causing urinary tract infection in animals. We investigated the antibiotic resistance and virulence genes of pathogenicE. coliCCHTP derived from urine with occult blood of the giant panda by whole genome sequencing. The flanking sequencing of resistance and virulence genes in genomic islands were also analyzed. Our results demonstrate thatE. coliCCHTP contains different families of antibiotic resistance genes, most of which are efflux pump related genes, including multiple drug resistance efflux pump genesmdfA,emrE, andmdtN. A total of 166 virulence factors and 563 virulence genes were identified, and the most virulence factors and related genes are involved in host cell attachment and invasion processes. Furthermore, sequence analysis of 19 genomic islands revealed that antibiotic and virulence genes are associated with mobile genetic elements (transposon and insertion sequence) in GIs011 and GIs017. These structures can mediate horizontal transfer of antibiotic and virulence genes. Our work described the distribution of antibiotic resistance genes and virulence genes inE. coliCCHTP, which may provide an important guidance for treatment and rational drug use ofE. coliCCHTP infection in the giant panda.

Keywords:giant panda;Escherichia coli; whole genome sequencing; resistance gene; virulence gene

大肠杆菌(Escherichia coli)通常存在于人和动物的胃肠道，属于条件性致病菌，在宿主康健的情况下，可起到掩护宿主、防止病原菌定植的作用，但在特定情况下会发生致病性[1]。此外，致病性大肠杆菌还可在胃肠道以外，如尿道、血液中生存并引起严重的疾病，它们具有广泛的宿主谱，其防治仍是当今世界性的难题，对大熊猫熏染性疾病的发生有重要影响[2,3]。

现在，用于治疗大熊猫细菌熏染的药物主要为抗生素，抗生素通过直接杀死或抑制病原菌的生长来到达治疗效果，这种作用机理使细菌具有选择压力，并催生病原菌耐药性的发生[4]。同时，由于耐药基因的水平转移特性使耐药性可在差别细菌种属间举行流传，加速了耐药水平的提高。研究讲明大熊猫源大肠杆菌已对差别大类抗生素，如四环素类、磺胺类和β-内酰胺类抗生素出现出差别水平耐药[5]。此外，毒力因子是病原菌具有的能够使其在宿主情况中定植、繁殖和致病的基因产物[6]。大肠杆菌的致病性是由多种毒力相关因子配合决议，这些毒力因子相互协调，直接或间接到场与致病历程，进而引发宿主有害炎症反映。近年来随着基因组学的飞速生长，可从分子水平对毒力因子举行研究，展现病原菌致病机理[7]。

现在关于大熊猫源大肠杆菌的研究主要集中在对大熊猫肠道内大肠杆菌的分散判定、耐药性检测

等[3,5,8]，但有关大熊猫肠外大肠杆菌相关的研究报道还较少。本实验通过对1株从泌尿生殖道熏染泛起潜血的大熊猫尿液中分散的大肠杆菌举行全基因测序，研究耐药及毒力因子情况，分析耐药及毒力相关基因的情况，可对大肠杆菌致病机理研究提供理论基础，为合理接纳抗生素治疗大熊猫大肠杆菌熏染提供依据。

1质料与方法

1.1菌株泉源

2017年5月从中国大熊猫掩护研究中心一只泌尿生殖道熏染泛起潜血的大熊猫尿液中分散获得的大肠杆菌。

1.2菌株纯化判定

大肠杆菌使用EMB造就基和TSA划线纯化，将纯化菌株腹腔注射小白鼠举行致病性实验[9]，确认后按文献[1]的方法举行形态学和16S rDNA测序再次判定确认，判定效果为大肠杆菌(Escherichia coliCCHTP)。挑取单菌落，使用TSB造就基造就18~20 h，取1.8 mL留宿孵育的菌液到一个2 mL无菌离心管中，离心后吸掉上清造就基，获取大肠杆菌沉淀用于后续DNA提取。

1.3抗生素药敏试验

凭据美国临床和实验室尺度协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSL) 2019年公布的《抗菌药物敏感性试验执行尺度》[10]，接纳K-B药敏纸片法，选择15种抗生素测定菌株的敏感性。使用无菌生理盐水稀释菌落制备菌悬浮液至0.5麦氏浓度，用无菌棉签蘸取菌液涂布于MHA琼脂平板上，镊子灭菌后划分夹取药敏纸片，按一定距离贴在平板的差别区域，37℃恒温造就16~18 h。按CLSI尺度判断耐药性。选择E. coliATCC25922,E. coliATCC35218作为质控菌株。

1.4 DNA提取

凭据UltraCleanMicrobial DNA Isolation Kit试剂盒手册，提取细菌DNA。取60 ng DNA样品1.0%琼脂糖凝胶电泳，在80V电压电泳30 min，检测DNA浓度。

1.5全基因组测序

将DNA送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司(Novogene)举行3代Pacbio平台测序。经电泳检测及格的DNA样品用Covaris g-TUBE打断成构建文库所需巨细的目的片段，经DNA损伤修复及末了修复后，使用DNA黏合酶将发卡型讨论毗连在DNA片段两头，使用AMpure PB磁珠对DNA片段举行纯化选择，构建SMRT Bell文库。纯化后的片段经buffer回溶后，使用BluePipin片段筛选特定巨细的片段，并使用AMpure PB磁珠对DNA片段举行纯化。构建好的文库经Qubit浓度定量，并使用Agilent 2100检测插入片段巨细，随后用PacBio平台举行测序。

1.6数据处置惩罚

对原始数据举行过滤处置惩罚，获得有效数据(clean data)。使用SMRT Link v5.0.1软件对reads举行组装[11,12]，获得开端组装效果，把reads比对到组装序列上，统计测序深度的漫衍情况。将获得的开端组装效果举行比对分析，并将染色体序列组装成为一个环状基因组，即最终的0 gap完成图序列。使用GeneMarkS软件(http://topaz.gatech.edu/)举行细菌的编码基因预测基因。注释使用Blastn数据库(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以及RAST[13]。接纳毒力因子数据库(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria, VFDB)和抗生素耐药基因数据库(the Comprehensive Antibiotic Research Database, CARD)[14]对菌株的基因组中所包罗的毒力基因和耐药基因举行比对，使用IslandPath-DIOMB软件预测基因岛。

2效果与分析

2.1药敏实验效果

药敏实验效果显示，获得的大肠杆菌CCHTP对阿莫西林、氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克洛、头孢曲松、头孢噻肟、庆大霉素、红霉素、阿奇霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和四环素耐药，对氨曲南和卡那霉素敏感(附表1)。

2.2大肠杆菌CCHTP全基因组测序效果

大肠杆菌CCHTP经PacBio测序平台举行全基因组测序后，通过对所测序列举行组装，最终获得1个contig，组装的contigs总长度为5120 663 bp，N50为5120 663 bp。通过组装获得一个长度为5106 047 bp的环状染色体序列(图1)，鸟嘌呤–胞嘧啶(GC)含量为50.49%对基因组编码基因预测，注释获得的基因总数为4896，注释获得的基因总长度为4470 000 bp。对基因组非编码RNA (ncRNA)预测，获得61个sRNA、22个rRNA (包罗5S、16S、23S)和89个tRNA。

经预测，共有4431个基因具有COG功效分类，其中信息储存和处置惩罚基因共745个，细胞历程和信号转导基因共1194个，代谢类基因共1945个，功效未知基因547个。菌株共有13 862个基因在GO数据库3大分支数据库中被注释到。共有43种功效注释效果，其中细胞学组件类有12个分支，共3360个注释效果，生物学途径类有23个分支，共7432基因注释效果，分子功效类存在10个分支共4107个相关注释效果。KEGG分析显示，共1544 个基因富集在 192条代谢通路中，其中涉及基因最多的通路主要有ABC转运卵白代谢通路(ko02010) (200个基因)、双组分调治系统代谢通(ko02060) (142个基因)和嘌呤代谢通路(ko00230) (83个基因)。

图1大肠杆菌CCHTP基因组图谱

Fig. 1 The chromosome genome ofE. coliCCHTP

从外圈至内圈：1、2圈为编码基因；3、4圈为eggNOG；4、5圈为KEGG；7、8圈为GO；9、10圈为ncRNA；11、12圈为基因组GC含量；13、14圈为基因组GC skew值漫衍。

2.3大肠杆菌CCHTP中抗生素耐药基因分析

通过对染色体基因序列举行比对，发现大肠杆菌携带了多种类型的抗生素耐药基因，包罗14大类161个抗生素耐药基因。从表1中可知，外排泵系统基因数量最多，主要包罗macB (13个)、adeL (6个)、patA (6个)、evgS (5个)等115个耐药基因。其次为介导糖肽类抗生素(万古霉素)耐药的vanTG/ TC/RI等10个耐药基因、介导多肽类抗生素(多粘菌素)耐药的mcr-3、PmrF/E/C等9个耐药基因和介导四环素类抗生素(四环素)耐药的tetT/B(60)/A(48)/ 34。此外，少量介导喹诺酮类、磺胺类和β-内酰胺类等抗生素耐药的基因也在基因组中识别到。

2.4大肠杆菌CCHTP中毒力因子分析

经VFDB数据库比对，发现大肠杆菌CCHTP共携带了166种毒力因子及563个相关毒力基因。按毒力因子大类(黏附与侵袭、排泄系统、铁转运和细菌毒素)来分析，发现属于黏附与侵袭类的毒力因子及相关基因数量最多，共有47种毒力因子及239个相关毒力基因，毒力基因数量前15的黏附与侵袭类毒力因子如图2所示，主要黏附因子包罗5种菌

表1大肠杆菌CCHTP中耐药基因分析效果

Table 1 Basic information of antibiotic resistance genes inE. coliCCHTP

毛类：Type I fimbriae (Ⅰ型菌毛)、TypeⅣpili (Ⅳ型菌毛)、Pix pilus (Pix菌毛)、Pap pilus (盂肾炎相关菌毛/P菌毛)和E.colicommon pilus (大肠杆菌共生菌毛)和3种鞭毛类：Peritrichous flagella (周生鞭毛)、S fimbriae (S鞭毛)和P fimbriae (P鞭毛)。研究发现Peritrichous flagella相关毒力基因数量最多，包罗filZ/Y/T/S、flhA/B/C/D、flgN/M/L等51个毒力基因，其次为LOS (脂寡糖)基因族中的rfaF/E/D、lpxK/H/ D/C等25个基因，Capsule (荚膜)基因族中的rmlA、oppF、lipA等15个基因和TypeⅠfimbriae基因族中的fimA/B/C等12个基因。

排泄系统共发现16种毒力因子及76个相关毒力基因(图3)。根据排泄系统类型来看，共识别到5类，属于Ⅱ型排泄系统的毒力因子类型最多，包罗gsp、T2SS、out、pul、GspA和exe，其次为Ⅵ型排泄系统，包罗ACE T6SS、SCI-I T6SS、CTS2和T6SS。其余3类排泄系统各识别到两种毒力因子，划分为Trehalose-recycling ABC transporter和ABC transporter (Ⅰ型排泄系统)、T3SS和IcsP (SopA) (Ⅲ型排泄系统)、CTS2和T6SS (Ⅵ型排泄系统)。与ACE T6SS相关的毒力基因数量最多，主要为假定卵白编码基因aec17/18/22/23/26等19个基因，其次为SCI-I T6SS基因族中的c3402、ECP_2814和LF82_ 443等17个基因。

图2黏附与侵袭类主要毒力因子

Fig. 2 Main virulence factors related to host cell attachment and invasion processes

图3排泄系统类主要毒力因子

Fig. 3 Main virulence factors of bacterial secretion systems

本研究共识别12种毒力因子及59个相关毒力基因属于铁转运系统。如图4所示，与毒力因子Enterobactin (肠细菌素)和血红素合成(Heme biosynthesis)相关的基因数量最多。其次为Yersiniabactin siderophore (耶尔森菌素合成)、Yersiniabactin (耶尔森菌素)及Salmochelin (沙门菌素)。

如图5，通过比对获得细菌毒素类毒力因子11种，毒力基因36个。毒力因子主要包罗5种溶血素：Alpha-hemolysin (α溶血素)、cytolysin A (溶血素A)、Hemolysin, HlyA (HlyA溶血素)、HemolysinⅢ(Ⅲ型溶血素)和Beta-hemolysin (β溶血素)。研究发现Colibactin (聚酮肽基因毒素)相关毒力基因数量最多, 包罗clbR/Q/P/O/N等19个基因。

2.5大肠杆菌E. coliCCHTP中耐药和毒力基因情况分析

在染色体序列共发现19个基因岛，总长在5187~74 031 bp之间，其中发现两个基因岛GIs011和GIs017上各有一段含可移动遗传元件(插入序列)、毒力因子和耐药基因的序列，基因情况绘图如图6所示，在基因岛GIs011上发现一段序列包罗外排泵基因调控因子(emrR)和四环素类耐药基因(tetA(60))，F1C菌毛(focY/H)和S菌毛(sfaG/F/E/D/A/B/C) 相关基因，在这些基因两侧存在可移动遗传元件IS630、转座酶基因及IS3fA。GIs017上也发现在一段包罗外排泵基因cpxR、α-溶血素基因hlyA/B/C/D及细菌毒素CNF-1，两侧划分与转座酶基因、插入序列IS3fB以及IS66相连，大肠杆菌中的耐药或毒力基因可由可移动遗传元件介导流传。

图4铁转运主要毒力因子

Fig. 4 Main virulence factors of iron-acquisition systems

图5细菌毒素主要毒力因子

Fig. 5 Main virulence factors of bacterial toxins

图6抗生素耐药基因和毒力基因情况

Fig. 6 Genetic environment of antibiotic resistance and virulence genes

此外，对多肽类耐药基因mcr-3及其侧翼情况举行分析(图7)，发现基因mcr-3一侧与假定抗性卵白(putative resistance protein, PRP)，并具有假定卵白(hypothetical protein, HP)YiaG。另一侧与假定卵白相连，并发现Capsule类毒力基因oppF与ABC转运器和假定卵白相连，另外在基因mcr-3周围序列中还发现chu类毒力基因chuA和chuT以及外排泵基因adeL、gadX、gadW和mdtE。

图7mcr-3基因情况

Fig. 7 Genetic environment ofmcr-3

PRP: putative resistance protein，假定抗性卵白；HP: hypothetical protein，假定卵白。

3讨论

许多已知的病原菌都能引起尿路熏染，如白色念珠菌(Candida albicans)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和大肠杆菌等[15,16]。然而，现在对大熊猫泌尿生殖道熏染的研究较少，仅发现肺炎克雷伯氏菌可引起大熊猫的泌尿生殖道血尿症泛起[17]。本研究从一只泌尿生殖道熏染泛起潜血的大熊猫尿液中分散出大肠杆菌CCHTP。通过全基因组测序，发现该菌携带多种类型的抗生素耐药基因，并以外排泵基因为主，讲明外排泵系统可能为大肠杆菌CCHTP发生耐药性的主要因素。此外，本研究还发现mdfA、emrE、mdtK和hmrM等多重耐药外排泵系统基因。现在已有大量研究讲明多重耐药外排泵能够介导反抗生素、消毒剂、洗涤剂和染料等有毒化合物的内在抗性[18]，阻止药物在细菌体内积累，是细菌多重耐药性发生的主要机制之一[19]。其中，mdfA外排泵能够外排环丙沙星，卡那霉素、新霉素及季铵盐类消毒剂等[20,21]，mdtK基因可表达细菌对诺氟沙星、阿霉素及吖啶黄的外排，emrE编码的外排泵能外排四环素、红霉素、结晶紫及染色剂溴化乙锭[22]。此外，研究检测到四环素类、磺胺类和β-内酰胺类耐药基因，这与部门学者在大熊猫粪便源大肠杆菌检测到耐药基因效果相似[5,23]。四环素类抗生素广泛用于动物疾病治疗 中，现在已发现40多种差别类型的四环素耐药基 因，主要介导3种耐药机制，划分为外排泵机制、核糖体掩护机制和酶降解机制[24]，其中基因tetA和tetB可编码主要易化子超家族(MFS)外排泵卵白将

四环素药物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，四环耐药基因tetT通过编码核糖体掩护机制，使耐药细菌可以发生核糖体掩护卵白与核糖体联合引起构型改变，从而弱化了对二甲胺四环素和强力霉素的抑制作用，导致耐药性的发生[25]。研究还发现多粘菌素耐药基因mcr-3，这种新型基因在2017年被Yin等[26]首次发现于大肠杆菌的IncHI2质粒中，其在大肠杆菌中的表达可有效阻止多粘菌素所引发的活性氧形成，并一定水平地对宿主细菌造成一定的代谢压力。研究讲明基因mcr-3的氨基酸序列与前期发现的多粘菌素基因mcr-1和mcr-2差异较大，仅有32.5%和31.7%的一致性[27]，具有多种亚型(如mcr-3.3、mcr-3.5和mcr-3.7)，宿主规模广，主要发现于大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中[28]。基因mcr-3可由染色体和质粒介导，通过质粒、插入序列、转座子等方式介导流传[27,29]。Ling等[29]对气单胞菌中有染色体介导的mcr-3.3基因情况举行分析，与本实验中mcr-3基因情况对比发现具有部门相同的序列结构，基因两侧均有假定卵白，且其中一侧与假定卵白相连。但仍存在差异，体现为基因mcr-3.3周围序列中发现插入序列遗传标志ISAsI。此外，mcr-3基因可与其他耐药基因共存[28,30,31]，Liu等[27]发现由mcr-3位于IncP质粒中的TnAs3转座子上，并与IncHI2质粒携带的基因mcr-1和IncX3质粒携带的基因blaNDM-5共存于一株大肠杆菌中，引起多重耐药，进一步增强宿主细菌的耐药性。

近年来随着人们对于种种毒力因子的逐步相识，一些毒力因子的致病机理也逐渐被展现出来。通过与VFDB数据库比对，发现大肠杆菌E. coliCCHTP携带了大量毒力因子及相关毒力基因。例如属于黏附与侵袭类毒力因子的Ⅰ型菌毛，其普遍存在于大肠杆菌中，主要在大肠杆菌致病的第一阶段起作用[32,33]。Vizcarra等[33]研究显示Ⅰ型菌毛还能发生屏蔽效应增强细胞内细菌反抗生素的反抗能力，造成慢性熏染发生，讲明Ⅰ型菌毛对细菌抗生素耐药性的发生有一定影响。研究检测到了fimA/B/C/D/H等12个编码Ⅰ型菌毛的基因，其中fimC和fimD主要在协调菌毛装配及细菌致病历程中起作用，fimH介导 粘附作用[32]。此外，Ⅰ型菌毛和P菌毛都能介导大肠杆菌黏附于上尿道，也是尿道熏染发生的重要因素[33,34]。此外，细菌毒素类包罗多种溶血素，其中α溶血素毒力基因hlyA具有广谱杀细胞作用，可作用于红细胞、肾脏上皮细胞和免疫细胞，诱导细胞凋亡[35]。Reijer等[36]研究讲明溶血素在金黄色葡萄球菌生物膜形成等致病历程中也起着重要作用，增加了金葡菌的危害性。编码毒素Colibactin相关毒力的基因数量最多，该毒素可导致慢性有丝破裂、染色体畸变和基因突变频率增加，能够引发肿瘤[37]。本研究通过对基因岛分析发现，大量抗生素耐药及毒力基因两侧存在插入序列。 研究讲明插入序列是染色体特殊组成部门，可携带耐药基因转移，同时插入序列可通过自身携带的转座子提高耐药基因表达量从而提高细菌耐药水平[38,39]。因此，研究效果提示大肠杆菌中耐药或毒力基因可能通过可移动遗传元件介导流传。

排泄系统和铁转运系统虽未直接涉及致病历程，但对细菌致病性的发生也至关重要。现在在革兰氏阴性菌中已经发现并命名9种差别类型的排泄系统(Ⅰ~Ⅸ型)，致病菌借助排泄系统将特异卵白直接注入宿主细胞内，可导致细菌的定殖和熏染[40]。在本研究共识别到5类(Ⅰ~Ⅳ型)，其中Ⅲ型排泄系统广泛存在于革兰氏阴性致病菌，如耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌、副溶血性弧菌等中[7,41]。沙门菌素和肠杆菌素是肠杆菌科病原菌中常见的铁载体，其中肠杆菌素主要通过于血浆转铁卵白中的铁联合来促进细菌生长而引起熏染，与其他已知的铁载体卵白相比具有最高的铁亲和力[42]。

综上所述，本研究通过全基因组测序技术首次对泌尿生殖道熏染泛起潜血的大熊猫尿液中分散的大肠杆菌举行检测，主要研究了其中毒力因子及耐药基因情况，可较为全面地预测大肠杆菌中耐药基因、耐药谱、毒力因子及相关毒力基因等重要致病特性。研究效果可为圈养大熊猫临床治疗和合理用药提供指导，为后续开展圈养大熊猫源病原菌中毒力因子和耐药基因研究提供依据。

附录：

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(责任编委: 谢建平)

附表1大肠杆菌CCHTP耐药情况

Supplementary Table 1 Antibiotic resistance ofE. coliCCHTP