癌症干细胞造就筛选一例：结肠癌干细胞

凭据肿瘤干细胞理论，肿瘤细胞中存在一类具有干细胞特性的细胞[被称为肿瘤干细胞（cancer stemcells, CSCs）或肿瘤起始细胞（cancer initiating cells, CICs）]，具有自我更新分化潜能，可不受外界调控形成恶性肿瘤， 往往是肿瘤复发的泉源。近年越来越多研究证实了CSCs存在于多种实体瘤中，如脑胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等。

海内学者发现，人脑胶质瘤细胞能在含生长因子的无血清造就基（serum-free medium, SFM）中形成细胞球，这种细胞球由于富集CSCs而被称为脑CSCs球。虽然这种细胞的总体数量少少，但能瘤性克隆生长，从而发生差别表型的癌细胞亚群。现在认为CSCs是导致放化疗后肿瘤复发的原因，因此，研究CSCs有利于更好地明白肿瘤复发、转移和耐药性发生的机制，从而制定更为合理的治疗方案。

结肠癌是一种常见消化道恶性肿瘤，其恶性度较低，术后5年生存率较高，可是仍有40%～50%的患者因为复发而需放化疗。研究CSCs可提高治疗的针对性和有效性，具有更为实际的意义。本研究通过SFM造就HT29细胞系，克隆分散癌细胞亚群，并从形态学、分化、自我更新、交替造就以及细胞化学免疫等方面举行判定。

质料和方法

一、质料

所用试剂有双苯酰亚胺(Hoechst)33342(Sigma公司)、鼠抗人异硫氰酸荧光素（FITC）-CD44单克隆抗体（BectonDickinson 公司），0.5%(质量分数)胰酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）(Gibc公司)、RPMI1640细胞造就液(Gibco公司)、DMEM/F12细胞造就液（Gibco公司）、重组表皮生长因子(EGF，PeproTech公司)、碱性成纤维生长因子(bFGF，PeproTech 公司)、胰岛素（Sigma公司）、B27 因子（Sigma公司）、牛血清清卵白（BSA，Gibco公司）、胎牛血清（Sigma公司）、维拉帕米（verapamil，Sigma公司)、碘化丙啶(PI, Sigma公司)等。人结肠癌细胞株HT29由上海交通大学医学院隶属瑞金医院内科实验室生存。

二、方法

1. CSCs球细胞造就和诱导分化：SSM为含10%胎牛血清的RPMI1640造就基，SFM由DMEM/F12(1:1)、B27 (1:50)、EGF (20 ng/mL)、bFGF (10 ng/mL)、4%BSA及1 mg/L胰岛素组成。

将结肠癌HT29细胞接种于SSM中，传代造就，待细胞处于对数生恒久，用磷酸缓冲液（PBS）清洗，0.5% Trypsin-EDTA 消化，重悬于SFM中，台盼兰染色计数活细胞后，以5×105/mL浓度于SFM中举行传代造就，置于显微镜下视察HT29细胞在SFM中形成CSCs 球的历程。将于SFM中形成的细胞球重新置于SSM中诱导其分化，显微镜视察细胞形态变化。

2. 流式细胞仪检测：收集SSM组和SFM组分化前、后的HT29细胞及细胞球（0.05% Trypsin-EDTA消化，重复吹打为单细胞悬液），0.5%Trypsin-EDTA消化，PBS漂洗并离心后重悬于PBS中，细胞计数约1×106/mL，鼠抗人FITC-CD44单克隆抗体标志，置于4 ℃孵育20 min; PBS洗2次后以流式细胞仪(FACSAria 流式细胞仪，BD 公司)检测和分选。流式检测均重复3次。

3. 双苯酰亚胺33342染色检测：选择对数生恒久的细胞，消化、漂洗并离心后，重悬于2 mL 含3%胎牛血清的RPMI1640造就液，密度1×106/mL，然后按5 μg/mL的终浓度加入双苯酰亚胺33342，对照组同时加入维拉帕米至终浓度50 μg/mL，37 ℃、5 %CO2、饱和湿度造就箱中孵育90 min ,每15 min将离心管轻轻晃动1次，使染料漫衍匀称。4 ℃离心后去尽造就液，酷寒PBS冲洗2次，加入酷寒3%胎牛血清的RPMI1640造就液2 mL及PI，使其终浓度为2 μg/mL，上机分选。应用流式细胞仪（Epics Altra,Beckman Coulter 公司），去除PI 阳性死细胞，收集侧群细胞（side population cells, SP） 和非SP（NSP）。

三、统计学方法

接纳SPSS10.0 统计软件举行数据分析，实验效果用x±s表现，2组资料均数比力接纳t磨练，P

效果

1.无血清造就结肠CSCs球的形成和诱导分化实验：无血清造就细胞球囊生长情况：HT29细胞接种于SFM中，24～48 h后发生少量体积较小、松散的悬浮肿瘤细胞球，而大部门细胞凋亡崩解，不能在SFM中生长。72 h后细胞球体积逐渐增大。1周后，部门细胞团较为松散，最终剖析并凋亡，此为细胞黏附形成的细胞球；一小部门细胞团连续扩增，形成形态较为规则的细胞球, 轻轻晃动造就瓶可见不多的细胞球沉于造就瓶瓶底。球内细胞折光性好, 毗连精密, 不能准确区分细胞间界线。新形成的CSCs球较为规则，新生单个细胞常以“出芽”的方式毗连在球体上（见图1）。

2． 球囊传代造就：细胞球传代时通过0.05%胰酶消化法和机械吹打法分散成单细胞悬液，24～48 h单个细胞相互聚集毗连成“树枝状”悬浮于SFM中，第3～4天形成不规则细胞球，第5～6天逐渐形成较为规则的细胞球。细胞球形态随传代次数增加而趋于规则。

3． 球囊细胞诱导分化：将于SFM中形成的结肠CSCs球重新置于SSM中后，第1天可见多数细胞球开始贴壁生长，但少数仍悬浮生长，第3天可见细胞球内细胞逐渐移行出细胞球，形成岛状细胞群，而悬浮生长的细胞球已不多见，随着“细胞岛”内细胞移出形成单层细胞贴壁生长，10 d后贴壁的单细胞层即可形成。

二、CD44 在HT29 结肠癌细胞系及悬浮造就细胞球中的表达情况

1. HT29 结肠癌细胞系中含有CD44+细胞：流式细胞仪检测分析可见横坐标为FITC 的荧光强度（标志鼠抗人CD44单抗）。检测到结肠癌细胞系HT29中CD44+细胞比例为（44.18±2.18）%（见图2A）。

2. 无血清悬浮造就可富集CD44+细胞：选择第6天的肿瘤细胞球检测无血清悬浮造就HT29细胞系所形成肿瘤细胞球，经鼠抗人CD44单抗标志后， 发现肿瘤细胞球细胞中CD44+细胞比例为（83.41±11.21）%（见图2B）。SSM 组与SFM 组相比，CD44+细胞比例有统计学差异（P

三、HT29细胞中SP细胞的分选

以维拉帕米能否阻止双苯酰亚胺33342染色判断所分选的结肠癌细胞系HT29 中是否含有SP细胞。HT29中含有少量SP细胞， 比例为（3.82±0.08）%（见图3A）；经由维拉帕米阻断后，HT29中SP亚群细胞比例显着淘汰，仅为0.34%（见图3B），证实HT29中确实含有一定比例的SP细胞。

讨论

CSCs学说最早在白血病研究中提出。在CSCs分选领域，现在有流式细胞仪分选及磁珠分选2 种主要方法，其中流式细胞仪可使用外貌抗原标志物或DNA染料举行分选。2007 年Ricci-Vitiani等从人结肠癌组织中分散和判定了外貌标志为CD133+的结肠CSCs，约占细胞总量的2.5%。经判定发现具有干细胞特性。然而，有学者发现每5.7×104个隐窝干细胞中有1个结肠癌起始细胞，每262个CD133+的结肠癌细胞中有1 个干细胞样细胞，其倍数相差大于200倍，CD133作为结肠CSCs标志的准确性受到了挑战。近年来，乳腺癌及前列腺癌等上皮泉源肿瘤中CD44+CSCs样细胞的发现对结肠CSCs研究带来新的启示。Chu 等从人结肠癌原代细胞中分选获得CD44+细胞，并举行了克隆形成实验及小鼠体内成瘤实验等干细胞生物学特性判定，进一步证明晰CD44也是结肠CSCs的待选外貌标志物。

SP细胞是1996 年Goodell 等在研究经双苯酰亚胺33342染色的小鼠骨髓时，通过带有紫外引发装置的流式细胞仪检测双波长划分为蓝色和红色荧光，分散出一小群细胞，这群细胞出现双苯酰亚胺33342低染，在流式二维分析点阵图上出现彗星尾状微雨细胞主体的一侧。这群细胞不仅表达造血干细胞外貌标志CD34 及CD38, 而且仅正常量的千分之一即可重建骨髓造血系统，在随后的研究中发现其具有干细胞样的特性，可作为分选干细胞的新表型。Goodell等在研究中发现，SP细胞通过ATP 联合盒式卵白（ABC）转运家族中的多药耐药基因1（即MDR1 或ABCG2）泵出双苯酰亚胺33342，在加入ABCG2 的抑制剂维拉帕米后，SP细胞数量显着下降。

而在多种肿瘤组织及差别肿瘤细胞系中发现也有比例不等的SP细胞。现在在多种实体瘤细胞系中也发现少量具有干细胞样特性的SP细胞存在。在结肠癌的研究中，2006年Haraguchi等从多种已稳定建系的结肠癌细胞系中分散获得SP细胞，其含量占总数的0.3%～0.7%。

然而，由于分散到的CSCs样细胞数量太少，难以支持后续实验的开展。外洋学者在恒久研究中发现， 加入EGF和bFGF的SFM有利于正常成体干细胞的体外扩增。有学者在正常神经干细胞研究中发现，将正常脑组织中的神经干细胞在含EGF和bFGF的SFM中造就，在bFGF作用下具有bFGF反映性的神经干细胞，不仅可以通过差池称破裂举行自我更新保持自我，而且可生成具有EGF反映性的干/祖细胞，而在EGF作用下具有EGF反映性的干细胞，通过对称破裂举行自我增殖，并通过差池称破裂来生成具有bFGF反映性的神经干细胞。总之，神经干细胞在EGF和bFGF的作用下，可扩增数量并维持干细胞多向分化潜能。

无血清造就不仅可用于正常干细胞，CSCs在该条件下也可保持为分化状态生长。乳腺癌、恶性神经系统肿瘤、结肠癌等恶性肿瘤细胞制成单细胞悬液，在不含血清仅含有EGF、bFGF的DMEM/F12造就基条件下，大部门分化的肿瘤细胞不耐受无血清情况在数天内死亡，而少少部门未分化的CSCs可生存并形成细胞球悬浮生长。这些细胞球富含CSCs，消化后可在含血清造就基中被诱导分化。因此，我们推测，选择合适配比的SFM可有效富集CSCs， 再进一步可举行免疫法或外貌标志等方法纯化CSCs。

CSCs球分化后的肿瘤细胞经免疫、细胞学检测，与普通细胞系细胞无异。在本次研究中，我们革新了SFM配方， 在其中加入具有生长因子作用的胰岛素以及血清的替代物B27、有利于细胞球形成。因此，经由革新的SFM对CSCs 球的生长速度、形成状态、形成时间均更为有利。

在本次研究中我们发现， 接纳了革新配方的SFM悬浮造就肿瘤细胞，大部门已分化的HT29细胞不能形成细胞球，并在1～2 d内凋亡崩解；而少数细胞以“出芽”方式逐渐由单个细胞形成细胞球，时间在3～5 d，并发现其细胞具有可不停自我更新、增殖并分化的生物学特性。

研究中我们选择了细胞外貌抗原CD44来纯化CSCs，CD44 是原始的、未分化的外貌标志。近年来，乳腺癌及前列腺癌等上皮泉源肿瘤中CD44+CSCs样细胞的发现对结肠CSCs 标志物带来新的启示。本研究发现，CSCs球CD44高表达，而且其比例显着高于SSM 中造就的普通HT29 细胞。我们认为HT29细胞中存在一定比例的CSCs，在SFM中CSCs可被富集并不停扩增维持未分化状态，这一发现为以后的进一步研究提供了一个平台。

流式细胞仪分选CSCs 的方法自从在白血病研究中开始后广泛应用于实体瘤CSCs研究中。本实验中，我们发现结肠癌细胞株HT29种存在SP细胞，比例为（3.82±0.08）%，与文献中其他结肠癌细胞株相比，这一比例较高（高于1%）， 有利于CSCs 研究的进一步开展。

综上所述，HT29 细胞中确实存在一定比例的细胞，可在SFM中悬浮生长并形成CSCs 球，与SSM中造就的HT29细胞相比，肿瘤球细胞高表达CD44，且其在悬浮生长历程中体现出了干细胞自我更新、无限增殖和分化能力的生物学特性。在HT29细胞中可检测到一定比例的SP细胞。这为我们进一步研究结肠CSCs奠基了技术基础。

转载：无血清悬浮法造就结肠癌HT29细胞系及肿瘤干细胞样亚群筛选，《J Intern Med Concepts Pract》，如有侵权请联系删除！