sgRNA长度调控编辑类型的植物双功效基因组编辑系统的建设

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克日,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、张华伟副研究员和农业资源研究中心张正斌研究员互助,在SCIENCE CHINA Life Sciences(《中国科学:生命科学》英文版)在线揭晓了题为“Shortening the sgRNA-DNA interface enables SpCas9 and eSpCas9(1.1) to nick the target DNA strand”的论文。

该论文首次通过实验证明晰缩短spacer长度能够使SpCas9和eSpCas(1.1)体现出类似于nCas9(D10A)的切口酶活性,从机制方面解释了改变spacer的长度导致SpCas9和eSpCas9(1.1)核酸酶活性降低的原因。基于此发现,作者开发了由胞嘧啶脱氨酶(APOBE3A)、eSpCas9(1.1)与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合而成的植物双功效基因组编辑系统。通常情况下,当spacer长度为20 nt时,双功效基因组编辑系统APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI能在靶位点处发生Indels (insertion/deletion)突变;当spacer长度为19 nt时,APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI体现出胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的碱基编辑活性。因此,该系统可同时对多个靶位点划分实施差别类型的编辑,为基因功效研究和分子设计育种提供了新的工具。

泉源于酿脓链球菌的SpCas9是研究最早应用最为广泛的CRISPR/Cas9系统。已有的研究讲明缩短或者增加spacer的长度可以提高SpCas9的特异性,同时研究发现改变spacer的长度也会影响SpCas9及其大部门变体的核酸酶活性,可是其作用机制并不清楚。该文通过实验证明缩短spacer的长度会使SpCas9和eSpCas9(1.1)体现出类似于nCas9(D10A)的切口酶活性。

基于此机制,作者开发了由胞嘧啶脱氨酶(APOBE3A)、eSpCas9(1.1))与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合而成的植物双功效基因组编辑系统。通过在水稻原生质中对9个内源基因位点举行测试,发现在大多数位点,当spacer长度为20 nt时,双功效基因组编辑系统APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI主要造成indels突变;当spacer长度为19 nt时,该系统主要行使胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的碱基替换的功效。

小麦乙酰乳酸合成酶基因 TaALS-P174位点的胞嘧啶替换为胸腺嘧啶可以使小麦发生对除草剂烟嘧磺隆的抗性。此突变作为小麦遗传转化及组织造就历程中的筛选标志,可以提高突变体筛选效率。为了高效获得TaGW2基因的敲除突变体,作者构建了划分靶向小麦TaALS和TaGW2基因的spacer长度为19 nt和20 nt的双sgRNAs表达载体,与APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI载体配合转化小麦未成熟胚。在植物组织造就的历程中添加0.254 mg/L的烟嘧磺隆举行筛选,获得了8棵小麦再生植株,经检测这8棵植株中TaALS和TaGW2基因共编辑效率到达100%。

作物传统的杂交育种历程中,由于基因连锁导致一些优异等位变异难以聚合。植物双功效基因组编辑系统可以克服基因连锁的限制,快速的实现多种优良等位基因的聚合,加速作物基因功效研究和分子设计育种的历程。

该研究事情获得中国科学院战略性先导专项、国家转重大科技专项、国家自然科学基金委的等项目资助。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、张华伟副研究员以及农业资源研究中心张正斌研究员为配合通讯作者。农业资源研究中心博士生范荣和中国科学院遗传与发育生物学研究所直博生柴壮壮为配合第一作者。