人类首次人工合成活新冠病毒：瑞士团队使用已知基因序列构建

克日，瑞士一个科研团队在已知新冠病毒基因序列的基础上，通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。该技术能高效合成新冠病毒，尤其在新暴发病毒尚未被乐成分散出之前，可以资助科学家尽快向卫生部门和实验室提供感染性病毒毒株，且该替代方案更为高效、宁静。

以上结果披露自预印本网站BioRxiv于当地时间2月21日揭晓了一篇名为“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”的论文。该尚未经同行审议。研究团队首次在试验中，使用合成基因组学平台快速重建了新冠病毒。

值得注意的是，这是一项凭据已知病毒基因组举行病毒重建的基础研究事情，该结果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关，本研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情暴发后，凭据已经宣布的病毒基因组序列举行的病毒重建研究。

该项研究的作者大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家，他们团结德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构配合完成了上述结果。

研究团队认为，使用已知的病毒基因组序列，通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供感染性病毒毒株的替代方法，还可以对单个基因举行遗传修饰和功效表征，从而争取时间对疫情暴发做出快速反映。

论文中提到，反向遗传学被认为是一种不行或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。研究团队此次报道了一个基于酵母的合成基因组学平台，用于多种RNA病毒的基因重建，包罗冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员。

研究人员可使用病毒分散物、克隆病毒DNA、临床样本或合成DNA生成病毒亚基因组片段，然后使用转化偶联重组技术 (TAR)克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体（YAC），从而在酿酒酵母中实现一步重组。T7-RNA聚合酶被用于发生病毒RNA，进而可以发生活病毒。

研究团队首先在其他RNA病毒（如鼠肝炎病毒MHV）中磨练了这一平台的准确度，团队测试了鼠肝炎病毒A59株中含有绿色荧光卵白（MHV GFP）的基因克隆能力，效果讲明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90％，这讲明病毒在酵母中的组装效率很高。

也正是使用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒举行了工程革新和复生。

病毒cDNA克隆及重组SARS-CoV-2和SARS-CoV-2-gfp的重建

详细来看，研究团队将病毒基因组分成12个片段，巨细在0.5kbp-3.4kbp。同时，为了便于血清学诊断和在细胞造就时追踪，研究团队将合成新冠病毒设计成可以表达GFP（绿色荧光卵白）。因此，研究团队又将片段11分成3个包罗GFP序列的子片段，GFP序列被插入ORF7a（开放阅读框，ORF)中从而在总计有14个片段。

研究团队让试剂公司化学合成上述14个DNA片段，1月14日下订单，2月4日拿到其中的12个片段。片段5和7在大肠杆菌中的克隆泛起一些问题未能完成。不外，研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本（SARS-CoV-2/München1.1/2020/929），他们决议使用RT-PCR扩增获得片段5和片段7。

使用TAR克隆，对于所有6种新冠病毒构建体，研究人员都获得了正确组装的分子克隆。随后，使用转化偶联重组技术 (TAR)，用酵母菌的同源重组系统依据末了重复的序列，将这些DNA序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病毒RNA，将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6（猴肾细胞）中，使得细胞被熏染，造就这些细胞的上清液（含释放出的病毒颗粒）注入到此外造就基中，可以熏染此外细胞。

研究团队进而表现，“我们能在获取病毒的合成DNA片段后仅一周的时间内，对最近盛行的新冠病毒的化学合成克隆举行工程革新和复生。”病毒的重组有很高的效率和准确度，通常情况下，凌驾90%的克隆是正确的。

值得注意的是，作者们指出，只管此前在酵母中举行同源重组已被用于许多分子病毒的克隆，但这一研究在对通过这种方法快速生成大型RNA病毒的全长cDNA的可行性举行了全面评估，尤其是这种大型RNA病毒在大肠杆菌中无法被稳定克隆。

使用合成基因组学平台克隆RNA病毒基因组

值得注意的是，除新冠病毒外，研究团队还报道了使用该技术合成构建MHV（鼠肝炎病毒，一种冠状病毒）和MERS-Cov等，HCov-229E和Zika病毒的构建仍在实验举行中。